技術(shù)文章
Technical articles目前對奶粉中脂溶性維生素A、D3、E測定的前處理方法多采用皂化方法去除脂肪[1-7],皂化過(guò)程后使用大量的有機溶劑進(jìn)行液液萃取以洗除雜質(zhì),操作步驟復雜,維生素D3樣品還需經(jīng)硅膠柱做進(jìn)一步的凈化才能進(jìn)行檢測,造成實(shí)驗時(shí)間成本的增加,不利于大批量樣品的檢測。本文研究了利用固相萃取法作為奶粉樣品的前處理方法,液相色譜法作為檢測手段,實(shí)現同時(shí)測定奶粉中維生素A、D3、E的含量,該方法可簡(jiǎn)化奶粉樣品的前處理過(guò)程,節省有機溶劑的使用,操作簡(jiǎn)便。
1. 樣品處理
皂化提取:2g奶粉加入1mL水混勻,加入1 mL VC/乙醇溶液破壁處理,混勻,加入10mL氫氧化鉀堿液(1.25g/mL),55℃條件下,水浴皂化45min,取出冷卻至室溫,向皂化液中加入適量無(wú)水乙醇,使之含50%乙醇,6000r/min離心5min后,取上清液,用1至2個(gè)微孔過(guò)濾器對其進(jìn)行過(guò)濾,至Qdaura 卓睿™全自動(dòng)固相萃取儀上樣管中作為待凈化液。
2. 固相萃取凈化
QdauraTM卓睿全自動(dòng)固相萃取儀程序設定:5mL甲醇,和5mL水活化,加樣,10mL50%乙醇/水淋洗,抽干20min。2mL 丙酮,10mL乙酸乙酯洗脫,收集。收集液于40℃氮氣吹干,1mL甲醇定容,0.45um PTFE過(guò)濾器過(guò)濾,準備進(jìn)液相色譜分析。
3. 色譜條件
液相色譜儀:LC-10F
色譜柱:Venusil MP C18,4.6 mm *150 mm,5µm;
流動(dòng)相:甲醇;
流速:1mL/min;
柱溫:30℃;
進(jìn)樣量:20µL;
波長(cháng)變化見(jiàn)表1:
表1 波長(cháng)變化梯度表
組分 | 時(shí)間/min | 波長(cháng)/nm |
維生素A | 0 | 325 |
維生素D3 | 5 | 264 |
維生素E | 9 | 294 |
4. 結果與討論
圖1 低濃度維生素標準溶液的色譜圖
從左至右依次為:維生素A(5.0µg/mL)、維生素D3(9.8µg/mL)、維生素E(99µg/mL)
4.1 工作曲線(xiàn)及檢出限
根據儀器對各個(gè)物質(zhì)的響應情況,將維生素A、D3、E分別由儲備液用正己烷逐級稀釋?zhuān)飨♂尦?個(gè)濃度,維生素A濃度范圍為0.25µg/mL~25µg/mL,維生素D3濃度范圍為0.30µg/mL~30µg/mL,維生素E濃度范圍為2.5µg/mL~250µg/mL,將溶液進(jìn)HPLC進(jìn)行檢測,計算出檢出限,回歸方程及檢出限見(jiàn)表2。可見(jiàn),液相色譜儀對維生素A、D3、E的響應與濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。
表2 線(xiàn)性回歸方程及檢出限
化合物 | 回歸方程 | 相關(guān)系數 | 檢出限 LOD* (µg/mL) |
維生素A | y=55.572*x-1.517 | 1 | 0.02 |
維生素D3 | y=57.608*x-1.9814 | 1 | 0.05 |
維生素E | y=8.1342*x-1.9094 | 1 | 0.39 |
圖2 皂化-固相萃取法色譜圖
4.2 皂化-固相萃取和傳統皂化-液液萃取法的實(shí)驗效果對比
傳統皂化-液液萃取法參考《GB 5413.9—2010食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E 的測定》的樣品前處理2個(gè)奶粉(每個(gè)樣稱(chēng)取2g)的平行樣,作為參照。同時(shí)以皂化固相萃取法做兩個(gè)平行樣品。
表3 傳統皂化-液液萃取法與皂化固相萃取法的實(shí)驗結果對比
維生素A峰面積 | 維生素D峰面積 | 維生素E峰面積 | |
傳統皂化-液液萃取法 | 778 | 0 | 148 |
皂化固相萃取法 | 1500 | 0 | 716 |
由于選用的奶粉VD含量較低,沒(méi)有檢出。
從上述對比可以看出,皂化固相萃取法相比國標的皂化液液萃取法具有簡(jiǎn)單的優(yōu)勢,同時(shí)萃取效果更好。*的缺點(diǎn)是出峰靠前的維生素A附近有較多的弱保留物質(zhì)的干擾,但是依靠MP C18的強大的分離能力,可以實(shí)現分離維生素A和干擾物質(zhì)的基線(xiàn)分離。同時(shí)這些弱保留的物質(zhì)很容易被洗脫出色譜柱,所以不會(huì )對色譜柱造成較大的污染。
4.2.3加標回收率實(shí)驗
表4 加標回收率及精密度
化合物 | 樣1(%) | 樣2(%) | 樣3(%) | 樣4(%) | 樣5(%) | 平均回收率% | RSD(%,n=5) | |
低濃度 加標 | 維生素A | 89.91 | 91.48 | 86.12 | 89.59 | 90.12 | 89.44 | 2.33 |
維生D3 | 112.36 | 114.63 | 106.34 | 111.63 | 105.35 | 110.06 | 3.83 | |
維生素E | 85.58 | 86.87 | 81.83 | 85.64 | 84.56 | 84.90 | 2.86 | |
高濃度 加標 | 維生素A | 88.84 | 91.48 | 89.61 | 86.43 | 89.57 | 89.18 | 2.04 |
維生D3 | 93.06 | 94.65 | 93.19 | 90.38 | 92.86 | 92.83 | 1.66 | |
維生素E | 86.68 | 87.62 | 87.00 | 83.25 | 85.94 | 86.10 | 1.98 |
4.2.3 實(shí)際樣品檢測
根據所建立的方法分析了從市場(chǎng)上購買(mǎi)的3種品牌奶粉,分別編號為1號、2號和3號按照上述方法進(jìn)行樣品處理和檢測,所得維生素A、D3和E的含量結果見(jiàn)表6。
圖7. 2號奶粉樣品色譜圖
表6 奶粉中維生素含量(µg/g)
化合物 | 1號 (µg/g) | 2號 (µg/g) | 3號 (µg/g) |
維生素A | 6.008 | 42.5 | 165.0 |
維生素D3 | 0.392 | 0.000 | 0.463 |
維生素E | 5.712 | 6.231 | 9.344 |
4.3 結論
采用改進(jìn)后的皂化-固相萃取方法來(lái)替代傳統的皂化法來(lái)測定奶粉中維生素含量,皂化能充分提取出奶粉中維生素A,D,E,再經(jīng)過(guò)Cleanert Vitamin固相萃取柱進(jìn)行凈化吸附洗脫,既避免了傳統皂化中液液萃取中有機溶劑的大量使用,也簡(jiǎn)化了操作步驟,同時(shí)能滿(mǎn)足一般奶粉樣品的含量分析要求。
5.訂貨信息
產(chǎn)品名稱(chēng) | 規格包裝 | 訂貨號 |
LC-10F液相色譜儀 | 10ml/min,梯度系統,200-800nm雙波長(cháng)檢測器 | FL-LC010GS |
LC-10F液相色譜儀 | 配紫外可變波長(cháng)檢測器 | LC-10F |
CC-100分析型色譜柱溫箱 | 溫控范圍:5-70℃; 可安裝1-2支300mm色譜柱 | CC-100 |
Qdaura 卓睿™全自動(dòng)固相萃取儀 | 4通道24位 | SPE-40 |
Cleanert Vitamin脂溶性維生素萃取柱 | 1g/12mL , 20支/pk | V00012(報價(jià):1360元/盒) |
Venusil MP C18液相色譜柱 | 4.6 mm x150 mm,5µm | V952505-0 |
微孔過(guò)濾膜(PTFE疏水)-雙膜 | 045µm,直徑13mm,100/pk | AS041345-P |
微孔過(guò)濾膜(PVDF親水)-雙膜 | 0.45µm,直徑13mm,100/pk | AS073345-G |
一次性無(wú)菌注射器 | 5mL, 100/pk | ZSQ-5ML |
1.5mL樣品瓶 | 100/pk | 1109-0519 |
1.5mL樣品瓶蓋 | 100/pk | 0915-1819 |
甲醇 | 4×4L/瓶 | AH230-4 |
乙醇 | 4×4L/箱 | AH090-4 |
乙酸乙酯 | 4×4L/箱 | AH100-4 |
正己烷 | 4×4L/箱 | AH216-4 |